El clonamiento de genes consiste en la obtención de un gen de interés para su posterior introducción en una célula hospedante, con la finalidad de que esta célula adquiera una nueva característica que le confiera una ventaja selectiva, o bien, para que la célula sintetice un compuesto de interés comercial.

Las etapas en el proceso de clonamiento de genes son las siguientes:

El gen a clonar se puede obtener a partir del genoma total, por síntesis enzimática ó por síntesis química.

Obtención del genoma total: el genoma se fragmenta por métodos físicos (ejemplo sonicación ) ó enzimáticos (enzimas de restricción ) y el gen de interés se identifica mediante Southern Blot

Obtención por síntesis enzimática: se refiere a la síntesis de cDNA, es decir, de una secuencia de DNAds que se obtiene por retrotranscripción del RNAm.

Para lo esto el RNAm se incuba con un oligodT (oligodeoxitimidina) que hará las veces de primer, con la enzima transcriptasa inversa y con los 4dNTP (dATP, dGTP, dCTP y dTTP). El producto que se obtiene es un híbrido RNAm-DNA.

Luego se degrada la hebra del RNAm del heteroduplex con la enzima RNAsa H.

Finalmente la hebra de DNA es utilizada como templado por la enzima DNA polimerasa I, que en presencia de los 4dNTP sintetiza la hebra complementaria de DNA, originando un producto de DNAds, llamado cDNA que tiene la ventaja de no presentar intrones.

2. Obtención de la molécula de DNA recombinante

Esta etapa consiste básicamente en la unión del gen a clonar con otra molécula de DNA llamada vector de clonamiento.

Se conoce como molécula de DNA recombinante a la molécula híbrida formada por la unión covalente entre el gen a clonar y el DNA vector. Esta etapa 2, es una etapa esencial para el clonamiento de genes, pues permite que el gen de interés sea introducido dentro de la célula hospedante.

Los vectores son moléculas "carrier" de DNA, que deben cumplir con las siguientes características:

• llevar gen de origen de la replicación
• presentar un mapa de restricción conocido y con varios sitios únicos de reconocimiento
• tener genes marcadores
• debe ser de fácil recuperación de la célula hospedante

El gen de origen le permitirá al plásmido replicarse, junto al gen incorporado, dentro de la célula hospedante.

El mapa de restricción permite seleccionar un sitio donde insertar el gen; asimismo permite seleccionar la enzima de restricción a utilizar.

La presencia de genes marcadores ó reporteros en el vector permitirá en la siguiente etapa realizar una selección de las células hospedantes recombinantes.

Nomenclatura utilizada para denominar vectores de origen plasmidial:

pBR322

pEMBL8

Los vectores de expresión son vectores de clonamiento especializados, que aseguran la expresión del gen clonado en la célula hospedante. Por lo tanto estos vectores deben incluir secuencias regulatorias que estimulen la expresión del gen, es decir, la transcripción y luego la traducción del producto correspondiente. Entre estas secuencias regulatorias están los promotores que deben ser fuertes (de tipo constitutivos ó regulables), secuencias de término de transcripción y secuencias de término para la traducción posterior del RNAm. Además, después del promotor debe existir una secuencia llamada "polylinker" ó de unión, con sitios de reconocimiento para diferentes enzimas de restricción.

3. Unión gen a clonar con el vector:

El gen a clonar, independientemente de su método de obtención, presenta 2 extremos libre, en cambio, el vector es una molécula circular de DNA cerrada covalentemente.

Para introducir el gen a clonar en el vector, este último debe abrirse en un solo sitio, que sea conocido, y que no involucre el gen de origen de la replicación. Para abrir el vector son esenciales las enzimas de restricción.

En el caso más simple, asumamos que el gen a clonar se obtuvo del genoma total con la enzima EcoRI y que esta misma enzima se utilizó para abrir el vector. Esto permite la unión espontánea entre ambas moléculas de DNA. Para obtener la molécula final de DNA recombinantecerrada covalentemente, ésta se incuba con la enzima DNA ligasa, enzima que une grupos 3’OH con 5’P.

El gen a clonar se obtiene por síntesis química ó como cDNA, por lo tanto este gen presenta extremos ciegos y el vector se abre con una enzima de restricción que también deja extremos ciegos.

Como la unión de ambas moléculas ocurrirá sólo por complementaridad de bases, es indispensable otorgarles a ambas extremos complementarios. Una alternativa es el uso de la enzima transferasa terminal, de la siguiente manera:

DNA a clonar + dATP + enzima = en los extremos 3' se agregan colas homopoliméricas de Adenina

Vector abierto + dTTP + enzima = en los extremos 3' del vector se agregan colas homopoliméricas de timina

Entonces al mezclar el DNA a clonar con el vector, ocurre una unión espontánea entre ambos, a través de la complementaridad entre A con T. Esta molécula debe incubarse con la DNA ligasa antes de pasar a la siguiente etapa

4. Introducción de DNA recombinante a célula hospedante