Las enzimas de restricción son endonucleasas que reconocen una secuencia entre 4-8 bp en DNAds. El sitio de reconocimiento se llama sitio de restricción, y la enzima rompe un enlace fosfodiester en la hebra de arriba y otro enlace fosfodiester en la hebra complementaria.

Estas enzimas se encuentran en muchas especies de bacterias, donde funcionan in vivo como parte de un sistema de restricción y modificación (sistema R/M). Este sistema es análogo a un sistema inmune, y le permite distinguir a la bacteria entre su propio DNA y el DNA exógeno, siendo este último degradado por la enzima de restricción. El DNA propio no es reconocido por sus enzimas de restricción, puesto que previamente lo ha modificado por metilación a través de la acción de una metiltransferasa (enzima que transfiere grupos metilo desde S-adenosilmetionina a bases específicas).

Una sola enzima (multimérica, posee 3 subunidades) reconoce la secuencia específica de DNA, metila y restringe. Pero la restricción no ocurre en el sitio de reconocimiento, sino que es al azar y en sitios distantes al de reconocimiento.

Enzimas diferentes realizan la restricción y modificación. La restricción ocurre en el sitio de reconocimiento ó adyacente. Estas enzimas tipo II son las utilizadas en el clonamiento de genes, puesto que permiten romper el DNA en sitios específicos, y así, recuperar secuencias conocidas.

Se han identificado más de 2300 endonucleasas de restricción tipo II. Se denominan isoquizómeros a aquellas enzimas que han sido obtenidas de diferentes especies de bacterias, pero que reconocen la misma secuencia de DNA.

Las enzimas tipo II, dependiendo de su especificidad, al romper el DNA provocan 2 tipos de cortes:

Aunque se utilizan ambas clases de fragmentos (con extremos ciegos y con extremos escalonados), en ingeniería genética se prefieren aquellos con extremos complementarios, puesto que permiten la unión espontánea del gen a clonar con el vector. Si las moléculas a utilizar presentan extremos ciegos, hay que conferirles extremos cohesivos, por ejemplo utilizando la enzima transferasa terminal.

Y: significa pirimidina (C ó T)

N : significa cualquier nucleótido

Las secuencias de reconocimiento de las enzimas tipo II son de tipo palíndrome (se leen igual de izquierda a derecha que de derecha a izquierda).

La nomenclatura que se sigue para designar las enzimas de restricción es la siguiente:

Eco RI E = Escherichia, género

co = coli, especie